撰文
咸姐
蛋白质磷酸化是一种可逆的翻译后修饰，今天，关于它的故事就从年12月MolecularCell第一期出版说起（编者注：MolCell杂志年创刊，首任主编为BenjaminLewin），自那时以来，蛋白质磷酸化的基因组和蛋白质组学的惊人复杂性就已经显现出来，时至今日，已经发现的蛋白激酶和磷酸酶基因及其调控亚基的数量占人类所有基因的近2.5%。
25年前，基于对32P标记的细胞蛋白的2D凝胶分析，研究人员们已经预见到蛋白质磷酸化位点的总数将会很大，但直到年，第一个系统的基于质谱（MS）的磷酸化蛋白质组学研究才被公之于众。从此以后，磷酸化蛋白质组学技术突飞猛进，现在，在几个小时内就可以从培养的细胞或组织中识别出数千个丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）磷酸化位点。截至年1月底，PhosphoSitePlus数据库列出了约24万种独特的人类磷酸化位点，尽管其中许多位点只被发现过一两次，但考虑到人类基因组只有大约2万个蛋白质编码基因，这无疑是一个非常大的数字。
在20种天然氨基酸中有9种可以发生磷酸化，但是在过去的25年里，蛋白质磷酸化研究的主要重点都集中在了解三种羟基氨基酸（Ser、Thr和Tyr）的典型磷酸化是如何调节细胞和组织功能上，而忽视了6种非羟基氨基酸——组氨酸（His），精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸，谷氨酸和半胱氨酸——的磷酸化，即非典型磷酸化。这种非典型磷酸化已经开始作为一个重要的新领域出现，它无疑将进一步增加蛋白质磷酸化的复杂性。
年6月16日，来自美国索尔克生物研究所的TonyHunter教授在MolecularCell在线发表题为Ajourneyfromphosphotyrosinetophosphohistidineandbeyond”的观点文章，以6种非典型磷酸化中的组氨酸磷酸化（pHis）为主要焦点，阐述了过去几年中人们对组氨酸磷酸化的了解，并探讨了组氨酸磷酸化领域的未来，带领读者参与了一场从酪氨酸磷酸化到组氨酸磷酸化的奇妙之旅。
奇妙之旅的启程
20世纪30年代，蛋白质中酪氨酸可能被磷酸化的设想被首次提出。然而，这一设想被搁置了45年之多，直到研究者们发现多瘤病毒中间T抗原酪氨酸可在体外激酶反应中被磷酸化，酪氨酸磷酸化领域之门才正式开启。
在过去的40年中，酪氨酸磷酸化在细胞信号传导中的重要性已变得非常清楚，其功能范围涉及从表面受体信号传导到细胞周期进程和神经传递各方面。酪氨酸磷酸化作为一种新的细胞间通讯方式，在多细胞生物的成功发育中发挥了关键作用。而酪氨酸磷酸化失调在许多人类疾病，尤其是癌症中起着驱动作用。由于磷酸酪氨酸（pTyr）与pSer和pThr一样具有化学稳定性，因此破译酪氨酸磷酸化功能的进展相对较快。从32P标记到pTyr特异性抗体的研发，酪氨酸磷酸化功能的揭示日益加速。而有趣的是，研究人员发现，首批pTyr单抗之一——2G8，不仅可以识别pTyr，还可以识别ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）代谢酶中的磷酸组氨酸（pHis）。这意味着，如果提供正确的抗原，哺乳动物的免疫系统可能能够产生pHis特异性抗体，现在已经证明这是事实。
过去
pHis于年被首次报道，作为6个非典型磷酸化氨基酸之一，其独特之处在于它是唯一一种具有两种亚型的磷酸氨基酸，即1-pHis和3-pHis，其中磷酸盐分别与组氨酸咪唑环上的N-1或N-3位置相连（图1）。最初，pHis作为一种翻译后修饰（PTM）被发现存在于线粒体酶琥珀酰CoA合成酶（SCS）中；后来，研究人员发现，在其他几种代谢酶中，pHis也可以作为磷酸酶的中间体。
图1
如果pHis只是作为一种酶的中间体，那么将组氨酸磷酸化作为一种调控机制的研究可能会停滞不前。所幸的是，研究人员发现pHis上的磷酸基可以作为一个强大的磷酸基供体，转移到第二种蛋白质中的多种受体氨基酸以及小分子上。随后的研究也逐渐发现了缺乏酶活性的含有pHis的蛋白质。对于这些蛋白质，位点特异性His磷酸化原则上可以作为调节蛋白质功能的可逆的PTM，类似于Ser、Thr和Tyr磷酸化。但是，与它们不同的是，pHis是化学不稳定的，因此，确定His磷酸化位点是一项艰巨的任务，开发新方法对于检测和探索pHis生物学至关重要，如pHis特异性抗体。
2G8抗pTyr单抗与pHis的交叉反应以及越来越多的证据表明His磷酸化将具有广泛的生物学意义,使得pHis特异性抗体的研发成为必然。年，本文的作者以及多方实验室都开始了pHis特异性抗体开发的尝试，这一开始便是20年的投入和努力，直到年才正式获得pHis特异性抗体。这之后，又成功获得了抗1-pHis单抗和抗3-pHis单抗，其中还包括一种相对序列独立的、具有pHis亚型选择性的、并且不会与pTyr发生交叉反应的单抗，这些单抗还被证明适用于免疫印迹、免疫组化、免疫荧光和亲和纯化实验。如今，这些抗pHis单抗和多抗都已商业化，并被证明是非常有价值的工具。
现在
研究pHis这种不稳定蛋白质修饰的实验技术手段的匮乏一度拖慢了新的含有pHis蛋白质的发现和His磷酸化功能的研究进度，可喜的是，最近的技术进步正在加速推进之，尤其是pHis选择性抗体的出现以及富集和分析pHis蛋白质和多肽的新方法，已经开始加速pHis蛋白质及其His磷酸化位点的鉴定，使可逆的His磷酸化功能分析成为可能。各种pHis位点分析方法的涌现逐渐表明，pHis蛋白质组，尤其是哺乳动物细胞中，可能相当庞大，并且整个“隐藏”的非典型磷酸蛋白质组的大小可能与pTyr磷酸蛋白质组的大小相媲美。当然，值得注意的是，目前由不同研究人员和方法获得的已公布的pHis位点列表显示，即使在分析相同的人类细胞系时，磷酸化位点特性的重叠也相对较少，因此进一步验证新发现的pHis位点是必要的。
哺乳动物细胞中pHis蛋白质组的不断扩大引发了一个新的问题，即是什么样的His激酶负责磷酸化所有这些蛋白质？但迄今为止，唯一候选的真核His激酶是核苷二磷酸（NDP）激酶的非转移蛋白（NME）家族，而且目前体外实验中，只有NME1和NME2两个成员被证明具有His激酶活性，而其他成员是否也可以作为蛋白激酶尚不清楚，尽管大多数成员已知在其活性位点His上自磷酸化。另一方面，若His的磷酸化是为了起到调节作用，那么蛋白质组氨酸磷酸酶的活性将是逆转His激酶作用所必需的。目前已知的有三种pHis磷酸酶（PHP）可以使pHis去磷酸化——PHPT1、PGAM5和LHPP，当然，PHP在对细胞内蛋白质上的pHis的转化中重要性还有待确定，而且依赖于特定pHis位点周围的序列和细胞内局部酸性pH值的pHis在蛋白质中的自发水解也可能发挥重要作用。
越来越多的证据表明，His磷酸化作用可以调节蛋白质功能，包括细胞周期进程、信号转导和RNA剪接/加工。年对神经母细胞瘤细胞中pHis位点的GO分析发现，His磷酸化参与糖酵解、粘着斑和细胞迁移、激酶信号和蛋白质翻译，而在HeLa细胞中则发现了其与大分子代谢、微管功能、RNA加工和转录的关系。随着大量pHis位点的验证和功能表征，未来无疑将出现His磷酸化新的功能。
未来
要使His磷酸化成为蛋白质磷酸化的主流，需要解决哪些关键问题呢？鉴于目前只有两种潜在的His激酶限制了底物的可能种类，因此首先要努力识别其他His激酶，并且寻找特定的PHP-pHis配对底物；其次需要更严格的确定pHis蛋白质组的成员；然后进行His磷酸化位点的功能验证，这可以遵循与典型磷酸化类似的策略，以产生非磷酸化突变体来表征pHis信号的丢失为切入点。还有一个难题在于His激酶如何选择蛋白质中的目标组氨酸残基，以及是什么决定了1-pHis还是3-pHis在特定位点的形成。另一个问题则是His磷酸化是否有二级结构要求，以及这如何影响N1或N3位点的磷酸化。
技术的发展无疑将在加速我们对His磷酸化的理解方面发挥重要作用。利用蛋白质工程技术提高pHis单克隆抗体的选择性和亲和力将是一个有益的进步，而针对功能重要的pHis位点制备位点特异性pHis抗体将是非常有价值的。当然，所有的一切努力都是为了最终揭示可逆的His磷酸化如何调节蛋白质功能，以及调节何种生物过程。毫无疑问，对His磷酸化的了解必将对其他非典型蛋白磷酸化的研究具有非常重要的价值。
奇妙之旅的最后
尽管自年BenjaminLewin（Cell期刊的创建者）将MolecularCell定位为“Cell的分子版本”的25年来的研究取得了快速的发展，但要了解蛋白质磷酸化网络是如何整合和利用的，还有很多工作要做。本文作者提出了一些亟待解决的问题，并指出在接下来的十年里，确定单个磷酸基的功能将继续是一项主要的任务，而且除了蛋白质磷酸化本身之外，要理解磷酸化和无数其他翻译后修饰之间复杂的相互作用，任重而道远。
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