qPCR入门干货，大家已经储备了qPCR的各种理论知识，了解的什么是qPCR以及qPCR的国际标准等。当准备进行qPCR实验时，新的问题又来了，实验该如何设计，要做绝对定量还是相对定量呢？绝对定量要怎么做？相对定量又是怎么做?本章就为大家介绍相对定量与绝对定量的内容及如何选择？
一、相对定量
1.相对定量的含义
相对定量是用于测定两个或多个不同样品中靶基因量的差异，得到的数据是目的基因在各样本中含量的相对比例。即将实验样本中靶基因的Ct值与对照样本的Ct值进行比较，结果用实验样本中靶基因量与对照样本中靶基因量的比值或差异倍数来表示。该方法在qPCR定量检测mRNA水平中最常见，研究生理变化对基因表达水平的影响。比如研究不同光照强度对毛竹Lhca基因表达量的影响，就可以使用相对定量方法来研究。
相对定量需要确保实验样本与对照样本的靶基因从等量原料中得到。Ct值与起始样品模板量的浓度相关，但是两组样品间浓度能否调至完全相同呢?这就要求样品细胞起始数、RNA提取效率、逆转录以及定量效率及操作必须完全一致，不存在操作误差等，这显然是无法达到的。最常用的是引入内参基因对样本的差异进行归一化。
2.什么是内参基因？
内参基因又称为“管家基因—housekeepinggene”，是指表达水平稳定却不受实验条件影响的一类基因。内参基因相当于一个标尺，具有校正作用，避免待测样本回收率或者加样误差等因素带来的差异；具有标准化作用，内参基因表达相对稳定，以其为参照，反应基因表达水平的变化。因为引入内参基因进行了归一化处理，可以最大限度地减少样本制备，处理时产生地各种差异规避对样本精确定量和上样的要求。
例如，我们要研究几个不同样本中某个RNA，但它的表达量可能会因为所处的环境和其他因素干扰而出现差异，因此从样本中提取出来的RNA总量也不相同。但由于内参基因RNA的表达是相对稳定的，甚至是无论在何时何地都会处于一个稳定的状态。所以在做PCR扩增时，就要对内参基因同时做PCR扩增。
3.如何选择内参基因？
理想的内参基因应该具备以下几个条件：
①不存在假基因(pseudogene),以避免基因组DNA的扩增；
②高度或中度表达,排除太高或低表达；
③稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；
④表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；
⑤其稳定的表达水平与目标基因相似；
⑥不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。
针对在不同条件下表达差异的基因、呈现细胞周期性依赖表达的基因以及定位于X染色体的基因，都不是作为内参基因的首要选择。
4.常见内参基因
目前常见的内参基因有β-actin，GAPDH，18SrRNA等。
（1）β-actin
Actin即“肌动蛋白”，是横纹肌肌纤维中的一种主要的蛋白成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。
β-actin几乎在所有的原核细胞中表达，广泛存在于哺乳动物的组织和细胞内，mRNA表达量非常丰富。其序列高度保守，因此也成为了一种公认的内参基因。
（2）GAPDH
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作标准化的内参。因为GAPDH作为内参基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参基因时，将每个样品测得的基因表达量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。
图一GAPDH结构图（3）18SrRNA
rRNA的合成通常是由聚合酶I合成，而mRNA是由聚合酶II合成的。因此，18SrRNA和28SrRNA的合成调节独立于mRNA，在影响mRNA表达的各种条件下，18SrRNA和28SrRNA水平很少发生变化，因此常用作内参基因。
没有一种基因能够在不同物种、不同组织器官、不同生理状态下永远保持恒定，所以我们需要根据自己的实验目的和样本类型去筛选最适合的内参基因。
首先通过查阅文章参考文献中所用内参基因，当没有已知可用的内参时，可以通过内参基因工具网站查阅：PCR内参基因知识库——ICG（网址